Институт генетики и биологии развития Китайской академии наук разработал систему геномного редактирования TKO и «мульти-в-одном» TRIM, обеспечив «однооконную» точную агрегацию сложных признаков сельскохозяйственных культур

В процессе селекции современных сельскохозяйственных культур, хотя множество превосходных аллелей уже было последовательно секвенировано и идентифицировано, задача их быстрой и точной агрегации в одном сорте по-прежнему сталкивается с техническими барьерами, связанными с многократными межпоколенными скрещиваниями и повторной экспериментальной оптимизацией. Научная группа Института генетики и биологии развития Китайской академии наук (Institute of Genetics and Developmental Biology, CAS) успешно преодолела эти трудности, разработав инструмент точного нокаута генов TKO и «мульти-в-одном» комплексную систему геномного редактирования TRIM (Targeted Replacement, Insertion and Mutagenesis), открыв новый путь для «однооконного» направленного улучшения сложных агрономических признаков.

В ответ на вызовы, связанные с длительными циклами и ограниченной эффективностью обычного генного редактирования при полиплоидных культурах и многогенном скоординированном улучшении, исследовательская группа на основе стратегии редактирования с двойными направляющими РНК (twin prime editing, twinPE) разработала высокоэффективный инструмент нокаута TKO, нацеленный на сайт-специфическую вставку кластеров стоп-кодонов (Stop codon clusters). Этот инструмент способен обеспечивать детерминированную инактивацию целевых генов путём точной записи стоп-кодонов, что механистически позволяет избежать проблемы внесения внутрирамковых мутаций (In-frame mutations), характерной для традиционной нуклеазы CRISPR/Cas9 из-за негомологичного соединения концов (NHEJ). Эксперименты показали, что TKO демонстрирует превосходную редактирующую активность в протопластах основных однодольных культур, таких как рис, пшеница и кукуруза, а средняя эффективность нокаута одного гена в регенерированных растениях риса поколения T0 достигает 96,8%. На этой основе было создано 10 взаимно ортогональных систем TKO, что позволило успешно осуществить одновременный точный нокаут до 10 генов в одном растении.

Чтобы дополнительно преодолеть ограничения, связанные с зависимостью различных типов генного редактирования от разрозненных инструментов, группа предложила «мульти-в-одном» архитектуру редактирования и последовательно разработала две интегрированные системы TRIM1 и TRIM2. При валидации на растениях риса поколения T0 система TRIM1 обеспечила одновременное выполнение нокаута 1 гена и гомозиготного точного редактирования 3 различных генов с эффективностью комплексного редактирования 22,8%; усовершенствованная система TRIM2 не только сохранила все возможности нокаута и редактирования оснований TRIM1, но и открыла возможность сайт-специфической вставки, замены, делеции, инверсии и хромосомной транслокации крупных фрагментов ДНК килобайтного (Kb) уровня и других высокоуровневых операций реконструкции генома.

Чтобы значительно снизить порог биоинформатического проектирования и конструирования векторов в «мокрых» экспериментах, научная группа одновременно разработала сопутствующее автоматизированное программное обеспечение для проектирования TKO_PegDesigner и создала стратегию высокоэффективной сборки множественных (pe)gRNA на основе двухраундового лигирования, позволяющую за одну реакцию осуществить высокопроизводительную сборку до 36 (pe)gRNA. Система TRIM впервые в мире интегрировала инактивацию генов путём нокаута, точное редактирование нуклеотидов и крупномасштабную реконструкцию хромосомной инженерии на единой технологической платформе, обеспечив мощную базовую инженерную инструментальную поддержку для направленной молекулярной селекции основных продовольственных и масличных культур и масштабной агрегации ключевых превосходных признаков.